IPTG (izopropil-β-D-tiogalaktozid) β-galaktozidaza substratining analogidir, u yuqori darajada induktsiyalanadi. IPTG induksiyasi ostida induktor repressor oqsili bilan kompleks hosil qilishi mumkin, shuning uchun repressor oqsilining konformatsiyasi o'zgaradi, shuning uchun uni maqsadli gen bilan birlashtirib bo'lmaydi va maqsadli gen samarali ifodalanadi. Xo'sh, tajriba davomida IPTG konsentratsiyasini qanday aniqlash kerak? Qancha katta bo'lsa, shuncha yaxshi?
Avvalo, IPTG induksiyasining tamoyilini tushunib olaylik: E. coli ning laktoza operoni (elementi) mos ravishda β-galaktozidaza, permeaza va atsetiltransferazani kodlaydigan uchta strukturaviy gen, Z, Y va A ni o'z ichiga oladi. lacZ laktozani glyukoza va galaktozaga yoki allo-laktozaga gidrolizlaydi; lacY atrof-muhitdagi laktozaning hujayra membranasidan o'tishiga va hujayraga kirishiga imkon beradi; lacA asetil guruhini asetil-CoA dan β-galaktozidga o'tkazadi, bu esa toksik ta'sirni yo'q qilishni o'z ichiga oladi. Bundan tashqari, O operatsion ketma-ketligi, P boshlang'ich ketma-ketligi va I regulyator geni mavjud. I gen kodi - bu operator ketma-ketligining O pozitsiyasiga bog'lanishi mumkin bo'lgan repressor oqsil, shuning uchun operon (meta) repressiya qilinadi va o'chiriladi. Shuningdek, katabolik gen aktivatori oqsil-CAP bog'lanish joyi uchun P boshlang'ich ketma-ketligidan yuqorida bog'lanish joyi mavjud. P ketma-ketligi, O ketma-ketligi va CAP bog'lanish joyi birgalikda lak operonining tartibga soluvchi mintaqasini tashkil qiladi. Uch fermentning kodlovchi genlari gen mahsulotlarining muvofiqlashtirilgan ifodalanishiga erishish uchun bir xil tartibga soluvchi mintaqa tomonidan tartibga solinadi.
Laktoza bo'lmaganda, lak operon (meta) repressiya holatida bo'ladi. Bu vaqtda, PI promotor ketma-ketligi nazorati ostida I ketma-ketligi bilan ifodalangan lak repressori O ketma-ketligiga bog'lanadi, bu RNK polimerazasining P ketma-ketligiga bog'lanishiga to'sqinlik qiladi va transkripsiya boshlanishini inhibe qiladi; laktoza mavjud bo'lganda, lak operon (meta) induksiya qilinishi mumkin. Ushbu operon (meta) tizimida haqiqiy induktor laktozaning o'zi emas. Laktoza hujayraga kiradi va β-galaktozidaza tomonidan katalizlanadi va allolaktozaga aylanadi. Ikkinchisi, induktor molekulasi sifatida, repressor oqsiliga bog'lanadi va oqsil konformatsiyasini o'zgartiradi, bu esa repressor oqsilining O ketma-ketligi va transkripsiyadan ajralib chiqishiga olib keladi. Izopropiltiogalaktozid (IPTG) allolaktoza bilan bir xil ta'sirga ega. Bu juda kuchli induktor bo'lib, bakteriyalar tomonidan metabolizmga uchramaydi va juda barqaror, shuning uchun u laboratoriyalarda keng qo'llaniladi.
IPTG ning optimal konsentratsiyasini qanday aniqlash mumkin? Misol tariqasida E. coli ni olaylik.
Musbat rekombinant pGEX (CGRP/msCT) ni o'z ichiga olgan E. coli BL21 genetik modifikatsiyalangan shtammi 50 μg·mL-1 Amperli LB suyuq muhitga emlandi va 37°C da bir kecha davomida kultivatsiya qilindi. Yuqoridagi kultura kengaytirish kulturasi uchun 1:100 nisbatda 50 mL yangi LB suyuq muhitga 10 ta shishaga emlandi va OD600 qiymati 0,6~0,8 ga teng bo'lganda, IPTG oxirgi konsentratsiyaga qo'shildi. U 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1 ga teng. Xuddi shu haroratda va bir vaqtning o'zida induksiya qilingandan so'ng, undan 1 ml bakterial eritma olindi va bakterial hujayralar santrifugatsiya yo'li bilan to'plandi va turli IPTG konsentratsiyalarining oqsil ekspressiyasiga ta'sirini tahlil qilish uchun SDS-PAGE ga duchor qilindi va keyin eng katta oqsil ekspressiyasiga ega IPTG konsentratsiyasi tanlandi.
Tajribalardan so'ng, IPTG konsentratsiyasi iloji boricha katta emasligi aniqlanadi. Buning sababi, IPTG bakteriyalar uchun ma'lum bir toksiklikka ega. Konsentratsiyadan oshib ketish hujayrani ham o'ldiradi; va umuman olganda, biz hujayrada ifodalangan eriydigan oqsil qancha ko'p bo'lsa, shuncha yaxshi deb umid qilamiz, lekin ko'p hollarda IPTG konsentratsiyasi juda yuqori bo'lganda, ko'p miqdorda qo'shilish hosil bo'ladi. Tana, lekin eriydigan oqsil miqdori kamayadi. Shuning uchun, eng mos IPTG konsentratsiyasi ko'pincha qanchalik katta bo'lsa, shuncha yaxshi emas, balki konsentratsiya shunchalik past bo'ladi.
Genetik modifikatsiyalangan shtammlarni induksiya qilish va yetishtirishning maqsadi maqsadli oqsil hosildorligini oshirish va xarajatlarni kamaytirishdir. Maqsadli genning ifodalanishiga nafaqat shtammning o'z omillari va plazmidning ifodalanishi, balki induktor konsentratsiyasi, induksiya harorati va induksiya vaqti kabi boshqa tashqi sharoitlar ham ta'sir qiladi. Shuning uchun, umuman olganda, noma'lum oqsil ifodalanishi va tozalanishidan oldin, mos sharoitlarni tanlash va eng yaxshi eksperimental natijalarni olish uchun induksiya vaqtini, haroratni va IPTG konsentratsiyasini o'rganish yaxshidir.
Nashr vaqti: 2021-yil 31-dekabr