IPTG (izopropil-b-D-tiogalaktozid) b-galaktozidaza substratining analogi bo'lib, u yuqori darajada induksiyaga ega.IPTG induktsiyasi ostida induktor repressor oqsili bilan kompleks hosil qilishi mumkin, shuning uchun repressor oqsilining konformatsiyasi o'zgaradi, shuning uchun uni maqsadli gen bilan birlashtirib bo'lmaydi va maqsadli gen samarali tarzda ifodalanadi.Xo'sh, tajriba davomida IPTG kontsentratsiyasini qanday aniqlash kerak?Qanchalik katta bo'lsa, shuncha yaxshimi?
Birinchidan, IPTG induksiyasi printsipini tushunamiz: E. coli ning laktoza operoni (elementi) uchta tizimli genlarni, Z, Y va A ni o'z ichiga oladi, ular mos ravishda b-galaktosidaza, permeaz va atsetiltransferazalarni kodlaydi.lacZ laktozani glyukoza va galaktozaga yoki allo-laktozaga gidrolizlaydi;lacY muhitdagi laktoza hujayra membranasidan o'tib, hujayra ichiga kiradi;lacA asetil guruhini atsetil-KoA dan b-galaktozidga o'tkazadi, bu Toksik ta'sirni yo'q qilishni o'z ichiga oladi.Bundan tashqari, operatsion ketma-ketlik O, boshlang'ich ketma-ketligi P va tartibga soluvchi gen I mavjud. I gen kodi repressor oqsil bo'lib, operator ketma-ketligining O pozitsiyasiga bog'lanishi mumkin, shuning uchun operon (meta) repressiya qilinadi va o'chirilgan.Bundan tashqari, katabolik gen faollashtiruvchi oqsil-CAP bog'lanish joyi P boshlang'ich ketma-ketligidan yuqorida joylashgan. P ketma-ketligi, O ketma-ketligi va CAP bog'lanish joyi birgalikda lak operonning tartibga soluvchi hududini tashkil qiladi.Gen mahsulotlarining muvofiqlashtirilgan ifodalanishiga erishish uchun uchta fermentning kodlash genlari bir xil tartibga soluvchi hudud tomonidan tartibga solinadi.
Laktoza bo'lmasa, lak operon (meta) repressiya holatida bo'ladi.Bu vaqtda, PI promotor ketma-ketligi nazorati ostida I ketma-ketligi bilan ifodalangan lak repressor O ketma-ketligiga bog'lanadi, bu RNK polimeraza P ketma-ketligi bilan bog'lanishiga to'sqinlik qiladi va transkripsiya boshlanishini inhibe qiladi;laktoza mavjud bo'lganda, lak operon (meta) induktsiya qilinishi mumkin Ushbu operon (meta) tizimida haqiqiy induktor laktozaning o'zi emas.Laktoza hujayra ichiga kiradi va allolaktozaga aylanishi uchun b-galaktozidaza tomonidan katalizlanadi.Ikkinchisi induktor molekulasi sifatida repressor oqsil bilan bog'lanadi va oqsil konformatsiyasini o'zgartiradi, bu esa repressor oqsilining O ketma-ketligi va transkripsiyasidan ajralib chiqishiga olib keladi.Izopropiltiogalaktozid (IPTG) allolaktoza bilan bir xil ta'sirga ega.Bu juda kuchli induktor bo'lib, u bakteriyalar tomonidan metabollashtirilmaydi va juda barqaror, shuning uchun u laboratoriyalarda keng qo'llaniladi.
IPTG ning optimal kontsentratsiyasini qanday aniqlash mumkin?Misol tariqasida E. coli ni olaylik.
Ijobiy rekombinant pGEX (CGRP/msCT) ni o'z ichiga olgan E. coli BL21 genetik jihatdan ishlab chiqilgan shtammi 50 mkg · ml-1 Amp bo'lgan LB suyuq muhitiga ekilgan va 37 ° C da bir kechada madaniyatlangan.Yuqoridagi madaniyat kengaytirish madaniyati uchun 1:100 nisbatda 50 mkg · ml-1 Amp o'z ichiga olgan 10 shisha 50 ml yangi LB suyuq muhitga ekilgan va OD600 qiymati 0,6 ~ 0,8 bo'lganida, IPTG yakuniy konsentratsiyaga qo'shilgan.U 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol · L-1 dir.Xuddi shu haroratda va bir vaqtning o'zida induksiya qilinganidan so'ng, undan 1 ml bakterial eritma olindi va bakterial hujayralar sentrifugalash yo'li bilan to'plandi va turli IPTG kontsentratsiyasining oqsil ifodasiga ta'sirini tahlil qilish uchun SDS-PAGEga o'tkazildi va keyin eng katta protein ifodasi bilan IPTG konsentratsiyasini tanlang.
Tajribalardan so'ng IPTG kontsentratsiyasi imkon qadar katta emasligi aniqlanadi.Buning sababi shundaki, IPTG bakteriyalar uchun ma'lum bir toksiklikka ega.Konsentratsiyadan oshib ketish ham hujayrani o'ldiradi;va umuman olganda, biz umid qilamizki, hujayrada ko'proq eruvchan protein ifodalangan bo'lsa, shuncha yaxshi bo'ladi, lekin ko'p hollarda IPTG kontsentratsiyasi juda yuqori bo'lsa, katta miqdordagi inklyuziya hosil bo'ladi.Tana, lekin eriydigan oqsil miqdori kamaydi.Shuning uchun IPTG kontsentratsiyasi ko'pincha qanchalik katta bo'lsa, shuncha yaxshi emas, balki kontsentratsiya qanchalik past bo'lsa.
Genetik muhandislik shtammlarini induksiya qilish va etishtirishdan maqsad maqsadli oqsil hosildorligini oshirish va xarajatlarni kamaytirishdir.Maqsadli genning ekspressiyasiga nafaqat shtammning o'z omillari va ekspression plazmid, balki induktorning konsentratsiyasi, induksiya harorati va induksiya vaqti kabi boshqa tashqi sharoitlar ham ta'sir qiladi.Shuning uchun, umuman olganda, noma'lum oqsilni ifodalash va tozalashdan oldin, tegishli sharoitlarni tanlash va eng yaxshi eksperimental natijalarni olish uchun induksiya vaqtini, haroratni va IPTG kontsentratsiyasini o'rganish yaxshidir.
Yuborilgan vaqt: 31-dekabr 2021-yil